qPCR（Quantitative real-time PCR）實驗中，模板質(zhì)量、引物設(shè)計、qPCR反應(yīng)體系、程序設(shè)置，均是影響實驗成功的重要因素。其中，qPCR的引物設(shè)計尤為重要，決定了qPCR擴增效率和擴增產(chǎn)物的特異性，引物設(shè)計都有哪些原則和要點，一起來了解一下吧！

qPCR引物設(shè)計原則

1. 引物長度一般在18~30 nt之間，擴增產(chǎn)物長度盡量控制在 80~200 bp之間。

引物設(shè)計太短會導(dǎo)致非特異擴增，太長則容易形成二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))。擴增產(chǎn)物太長會影響到PCR擴增效率。

2. 引物GC含量控制在40%~60%之間，正反向引物Tm值介于55~65℃之間，正反引物的Tm差值不超過3℃。

3. 引物3′端盡量避免選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)合成效率存在著很大的差異，當末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發(fā)鏈合成，而當末位為T時，錯配引發(fā)效率大大降低。

4. 單個堿基重復(fù)≤3個。

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，尤其3′端避免超過3個連續(xù)的G或C，因為3個以上連續(xù)的G或C容易在GC富集序列區(qū)產(chǎn)生錯誤引發(fā)。

5. 引物設(shè)計區(qū)域應(yīng)避開復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)。

擴增產(chǎn)物單鏈形成二級結(jié)構(gòu)會影響PCR順利進行，可用軟件（比如RNAstructure）預(yù)測靶序列是否存在二級結(jié)構(gòu)，盡量避開該區(qū)域設(shè)計引物。

6. 引物自身和引物之間應(yīng)盡量避免堿基連續(xù)互補。

引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補，引物自身存在互補序列會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合，而引物之間互補會產(chǎn)生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準確性。如果引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)不可避免，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。

7. 引物擴增的是目標特異產(chǎn)物。

qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現(xiàn)非特異擴增，定量會不準確。所以設(shè)計好引物后需要在序列數(shù)據(jù)庫中比對產(chǎn)物的特異性。


 

qPCR引物設(shè)計方法

以上我們了解了qPCR引物設(shè)計原則，看上去內(nèi)容多而復(fù)雜，在實際應(yīng)用中，我們可借助生物學軟件完成qPCR引物設(shè)計。常用的軟件有Primer-BLAST、Primer3、Primer Premier、Primer Express、Beacon Designer、Oligo 7等，NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST無需下載軟件，可以直接打開網(wǎng)頁設(shè)計引物，除了常規(guī)引物參數(shù)設(shè)置外，還可以設(shè)置跨越內(nèi)含子引物和檢測引物的特異性，應(yīng)用非常廣泛。接下來我們通過以下三步來學習利用Primer-BLAST成功設(shè)計qPCR引物。

01 查找目的基因序列

qPCR方法可以檢測基因組DNA含量，也可以檢測基因轉(zhuǎn)錄水平的表達量（RNA的含量），后者需要先提取組織部位的RNA，進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再做檢測。所以設(shè)計引物之前需要明確實驗?zāi)康?，明確模板是DNA還是cDNA，不同類型模板，需要下載的序列是不同的。基因表達量的檢測是目前qPCR的主要應(yīng)用方向，因此今天以基因表達量分析為例介紹qPCR引物的設(shè)計方法。

以水稻產(chǎn)量基因GW2為例設(shè)計引物，在NCBI數(shù)據(jù)庫主頁Gene數(shù)據(jù)庫中搜索GW2，獲得該基因mRNA的Accession號和FASTA序列。

02 設(shè)計引物

打開NCBI的Primer-BLAST頁面，出現(xiàn)PCR Template，Primer Parameters，Exon/intron selection，Primer Pair Specificity Checking Parameters四種參數(shù)設(shè)置。

① PCR Template是針對模板的設(shè)置，設(shè)計人員可以選擇輸入accession號、FASTA序列或者上傳FASTA序列文件等方式導(dǎo)入模板序列，優(yōu)先輸入accession號，這種方式在輸出頁面可以直觀地展現(xiàn)引物對應(yīng)外顯子的位置。Range可以指出引物位置范圍，如果我們只想在CDS區(qū)設(shè)計引物，可以把范圍直接鎖定在CDS區(qū)，此處未填寫代表全長序列都參與設(shè)計。

② Primer Parameters是針對引物參數(shù)的設(shè)置，本次為新引物設(shè)計，無需填寫引物序列。PCR產(chǎn)物大小建議設(shè)置為80~200 bp，如果模板復(fù)雜較難設(shè)置出合適的引物，產(chǎn)物大小可適當延長至300 bp。輸出引物對數(shù)和引物熔解溫度（Tm值）選擇默認設(shè)置即可。

③ Exon/intron selection是針對基因組序列對mRNA序列擴增結(jié)果有影響而設(shè)計的跨內(nèi)含子引物設(shè)計方案，參數(shù)包括引物是否跨越內(nèi)含子或者exon-exon拼接點，設(shè)置參數(shù)越多，可能導(dǎo)致設(shè)計不出合適引物。所以這欄建議選擇默認設(shè)置，后續(xù)通過引物與外顯子的相對位置來篩選引物。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters是針對引物特異性篩選的參數(shù)設(shè)置，數(shù)據(jù)庫和物種根據(jù)實際情況選擇，這里選擇了Refseq mRNA和水稻。有些基因可能存在可變剪切而有多個轉(zhuǎn)錄本，Allow splice variants處打勾代表可以擴增所有轉(zhuǎn)錄本（此時PCR template處應(yīng)輸入mRNA序列而非accession號）。其他參數(shù)選默認設(shè)置。

⑤ 點擊Get Primers，即自動生成合適引物。我們看到頁面中，Specificity of primers處描述“Primer pairs are specific to input template as no other targets were found in selected database: Refseq mRNA (Organism limited to Oryza sativa Japonica Group)"，代表10對引物均可特異性結(jié)合靶序列，我們可以選擇不同區(qū)域的兩對跨內(nèi)含子的引物進行后續(xù)預(yù)實驗驗證。

03 引物預(yù)實驗驗證

軟件設(shè)計的引物在理論上是可用的，而實際實驗中，會有很多未知的因素而無法得到理想結(jié)果，所以強烈建議用預(yù)實驗驗證引物的有效性。

cDNA原液以4為倍數(shù)進行倍比稀釋，得到4~6個梯度，同時用預(yù)選的引物對進行qPCR擴增（要設(shè)置NTC）。結(jié)束后觀察熔解曲線的特異性和標準曲線的擴增效率，如果熔解曲線單一、尖銳，初步判斷產(chǎn)物是特異的，擴增效率要介于90%~110%之間，越接近100%，定量越準確。滿足這些條件后，建議把PCR產(chǎn)物（謹防污染）做一代測序驗證序列的特異性。最后，根據(jù)實驗需要選擇合適的qPCR引物用于后續(xù)正式實驗即可。

補充Tips：

1. 這里介紹了一般的qPCR引物設(shè)計流程，如果仍沒有篩選到合適的引物，需要針對性的調(diào)整參數(shù)，必要時需要在Advanced parameters調(diào)整參數(shù)以設(shè)計到合適的引物。

2. 在表達量研究實驗中，基因組殘留對后續(xù)定量結(jié)果的影響是必須考慮的因素，可以有兩種方式來解決此問題，其中一種方式在引物設(shè)計里介紹過，即設(shè)計跨越內(nèi)含子的引物使基因組序列無法被擴增，另一種方式是在RNA提取過程中增加基因組去除的步驟，同時反轉(zhuǎn)錄實驗前也增加基因組去除的步驟以消除殘留DNA得到準確定量結(jié)果，后一種方式無需考慮引物設(shè)計的位置，引物設(shè)計更加簡化。

相信大家get到了利用Primer-BLAST設(shè)計qPCR引物的技術(shù)要點，引物設(shè)計非常重要，穩(wěn)定可靠、特異、靈敏的熒光定量試劑也很重要。TIANGEN的熒光定量產(chǎn)品質(zhì)量可靠、定量準確，一直以來受到廣大客戶的信賴。